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影响非洲猪瘟检测结果的因素分析:样品的前处理与核酸提取

2019-08-05

正确采集、运送、接收和保存样本是获得准确、可靠检验结果的首要环节,但临床检测样本种类多样,比如检测非洲猪瘟病原学样品就包括:唾液、全血、血清、组织、蜱、环境拭子等。
不同的样品需要选择合适的前处理和核酸提取方法,除去蛋白、脂类和核酸酶等干扰核酸扩增的物质,对保证检测结果的准确性十分重要。


其中,核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确与否,也是最容易出问题的环节。

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而核酸提取又跟样品的前处理密切相关,不同的样本类型,样品的前处理过程会有差异。


常见样品的前处理过程(简化版)


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1. 唾液:取唾液样品1ml加入1.5ml离心管中,离心3分钟,沉淀杂质,取上清液200ul用于核酸提取。

2. 全血:直接从采集的血样中取200ul用于核酸提取。

3. 血浆:1ml的抗凝血加入1.5ml离心管中,离心(3000rpm5分钟,取上清液200ul用于核酸提取。

4. 血清:1~2ml新鲜血液静置待血清析出或离心(3000rpm5分钟,取上清液200ul用于核酸提取。

5. 拭子:适用于鼻拭子、肛门拭子、咽拭子、水泡拭子等。将棉拭子样本置于1.5ml离心管中;加入1ml生理盐水,生理盐水以没过棉签头为宜,浸泡并震荡1分钟。

6. 精液:新鲜采集的精液,经室温放置30min,至呈液化状态;取其中1ml加入1.5ml离心管中,反复冻融不超过3次,以裂解细胞;离心3分钟,取上清200ul用于核酸提取。

7. 病毒培养液:直接吸取200μL原液用于核酸提取;或者使用生理盐水将原液稀释1:101:100,取200μL用于核酸提取。

8. 活疫苗冻干粉:使用生理盐水或疫苗稀释液稀释疫苗干粉(1mL/头份),并充分摇匀,直接吸取200μL用于核酸提取;或使用生理盐水将原液稀释1:101:100,取200μL用于核酸提取。

9. 饲料:对饲料样本先进行物理粉碎,然后浸泡15~30分钟,离心取上清液200μL用于核酸提取。

10. 病料组织:剪取病料病变边缘部位的组织,约米粒大小,置于1.5ml离心管中,吸取200ul生理盐水加入离心管,研磨处理至组织块完全分离,补充生理盐水至500μL,充分混匀后,取200μL用于核酸提取,剩余的低温留存用于复检。


为什么要进行核酸提取?

核酸提取纯化的目的是为了除去PCR抑制物,增加靶核酸浓度、增加样本的均一性,对于RNA的提取,要求更加严格。

常见的三种DNA提取方法
1. 一步法核酸免提取
——此方法简单、快速,适用于临床上组织、血清、血浆、拭子、体液、病毒培养物等样品的快速提取与扩张。

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2. 离心柱法提取核酸

——此方法克服了传统核酸提取的缺点,提高了全血、精液等复杂样本的核酸得率,减少血红素等阻化物对PCR的抑制,适用于微量核酸的提取。

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如进行RNA提取,需要注意RNA提取中RNase污染的控制,因为临床样本及实验室环境中存在大量对RNA有强降解作用的RNase。RNase耐高温,不易失活,我们必须控制RNase的污染,防止其对RNA的降解,这是成功提取RNA的关键。


不管是在样品的前处理,还是核酸提取过程,都涉及到实验操作过程,而将操作过程标准化是实验室操作人员最为核心最为重要的内容。

非洲猪瘟病毒的实验室检测涉及到PCR实验室的合理分区、标准的移液技术、正确的样品前处理、核酸提取、PCR实验室的清洁废弃物处理及环境的定期污染监测等。目前仅剩下PCR实验室的清洁废弃物处理及环境的定期污染监测尚未推送。

查看往期与非瘟现场检测相关推送内容,一步一步将非瘟病毒的检测过程标准化。
【视频】第二讲:掌声离心机的使用 | 实验室基础操作
【视频】第一讲:移液器的使用 | 实验室基础操作
【举例】降低实验室污染从合理的实验室区间划分操作开始
【因素】影响非瘟检测结果的首要环节:样品的正确采集及保存

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